【科學人談科學】超分辨顯微：突破衍射極限，向納米分辨進軍
主講人：光電信息工程學系超分辨光學顯微實驗室副教授匡翠方
衍射極限
我們能看到什么？看到多小的范圍？看得有多清楚？幾百年來，依靠不斷進步的科學手段，微觀世界正一層層揭開面紗，讓人們可以看得越來越“小”，進而可以進行研究。
人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物體，再小，就要借助工具。1665年，英國科學家羅伯特·虎克制造了第一臺用于科學研究的光學顯微鏡，用它觀察薄薄的軟木塞切片。虎克看到了殘存的植物細胞壁，它們一個個像小房間一樣緊挨在一起，這就是“細胞”一詞的由來。
此后，顯微鏡制造和顯微觀察技術的迅速發(fā)展，幫助科學家第一次發(fā)現了細菌和微生物。那么，光學顯微鏡是否可以無止境地“放大”下去，讓我們想看到多小就能看到多?。靠茖W家為此做了很多嘗試，最終發(fā)現，存在一道法逾越的“墻”———衍射極限。
1873年，德國科學家阿貝提出了衍射極限理論：光是一種電磁波，由于存在衍射，一個被觀測的點經過光學系統(tǒng)成像后，不可能得到理想的點，而是一個衍射像，每個物點就像一個彌散的斑，如果這兩個點靠得很近，彌散斑就疊加在一起，我們看到的就是一團模糊的圖像。
阿貝提出，分辨率的極限近似于入射光波長的二分之一(d=λ/2)?？梢姽獾牟ㄩL通常在380~780納米之間，根據衍射極限公式，光學顯微鏡的分辨率極限就在200納米（0.2微米）左右。如果物體小于0.2微米，你仍舊看到的是一個模糊的光斑。這就是很長一段時間內，光學顯微鏡的分辨極限。
這就是為什么后來有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、x光衍射儀等微觀觀測或者顯像設備，人們借助它們可以看得更“細”。那么，這些設備有沒有突破衍射極限呢？他們依然遵循著阿貝衍射極限。這些設備的使用的是電子束等波長非常短的入射光，自然，它們的分辨率就高。比如電子顯微鏡，分辨率可以達到0.5埃（一埃等于十分之一納米），這樣就可以看到一粒一粒的原子。
突破衍射極限
那么，光學顯微鏡是否已經完成它的使命，可以退出歷史舞臺了呢？目前，光學顯微鏡的研發(fā)還是世界科學家的研究熱點。生物學、醫(yī)學方面的研究，更希望在生命體存活的自然狀態(tài)下進行觀察，在這方面，光學顯微鏡有它不可比擬的優(yōu)勢。突破性的進展發(fā)生在本世紀初，一個是德國哥根廷大學的StefanHell教授提出的STED方法，一個是哈佛大學的莊小威提出的STORM方法。
STED的方法可以理解為“以光制光”。用另外一束環(huán)狀的光“疊加包圍”原有的光斑，這樣，原有的光斑的外圍部分會得到削弱，我們看到的就是更小的聚焦的點，這樣就會提高分辨率。采用這種方法的光學顯微鏡，分辨率可以達到30~50納米，可以清晰地看到細胞內部的微管。
2006年，哈佛大學莊小威從化學生物學角度提出了她的新方法，利用熒光探針家族，實現了多色隨機光學重建顯微法（multicolorstochasticopticalreconstructionmicroscopy）。她的核心原理是利用光線“開關”，“隨機”地讓被觀測物體上的點發(fā)光或熄滅，這樣就拉遠了兩個發(fā)光點之間的距離，相機不斷動態(tài)捕捉這樣的成像，再經過計算機分析，就會形成被觀測物體整體的圖像。這種方法，把光學顯微鏡的成像推進到20-30納米級別的分辨率，在《Science》雜志上，課題組演示了DNA模式樣品和哺乳動物細胞的多色成像。
以上這些進展,都讓光學顯微鏡突破了衍射極限，我們稱之為“超分辨成像技術”。美國光學學會把它列為21世紀光學五大研究計劃之首。
我們的原創(chuàng)進展
我們超分辨光學顯微課題組在劉旭教授的帶領下，很多年前就開始了超分辨成像技術的相關研究，在超分辨成像兩個主要分支上有了原創(chuàng)性進展。比如，我們搭建了國內首套門控熒光受激發(fā)射損耗(g-STED)光學顯微系統(tǒng)，它的基本原理與STED相似，但我們用了門控的方法，控制了“拍照”時間，這樣，它的空間分辨率可以達到38納米(~λ/14)，在此基礎上，我們又加入了微分方法進行優(yōu)化，這樣，分辨率還能進一步推進。在STORM這一分支，我們也給出了部分光點“隨機”呈現的另外一種方法：熒光自行消退的過程中，本身就是一個隨機的過程，我們將這一過程不同時期的照片做一個疊加分析和處理，便可以得到一幅清晰的、真實的、完整的圖像。
當前很多生物學、醫(yī)學方面的研究都會使用熒光標記，無論是STED還是STORM，觀測的都是被熒光標記過的細胞結構。那么沒有熒光標記的情況下，是否可以進行“天然”地超分辨觀察？這方面，我們也在探索，是否能夠通過被觀測物體的折射率來進行分析，目前，我們已經在實驗上提出了~λ/7分辨率的顯微裝置。
浙江大學的學科很齊全，我們經常和生儀學院、醫(yī)學院的教授聚在一起，聽聽他們在研究上的需求。目前，在生物和醫(yī)學研究應用比較廣泛的光學顯微鏡是共聚焦顯微鏡，而分辨率比它更高的超分辨顯微鏡，我國還只有個別研究機構有。最近，我們打算把我們搭建的g-STED光學顯微系統(tǒng)送到醫(yī)學院段樹民教授的實驗室，供科學家們使用。我們同時希望這一成果能很好地向產業(yè)界轉化，我們與寧波永新光學股份有限公司合作申請了寧波市科技創(chuàng)新團隊項目。
再回到科學，諾貝爾獎物理獎曾兩次頒給顯微鏡設計領域的科學家，1953年諾貝爾頒給了發(fā)明相襯顯微鏡的澤爾尼克，這種顯微鏡適用于觀察具有很高透明度的對象；1986年一半授予德國的恩斯特·魯斯卡,他設計了第一架電子顯微鏡；另一半則授予了設計出掃描隧道顯微鏡的魯西利康和羅雷爾。那么，突破衍射極限的超分辨電子顯微鏡的發(fā)明會不會獲獎呢？現在還很難說，這要看這一技術是否真正對生物學、醫(yī)學等領域的研究產生了變革性的推動了。希望超分辨顯微技術能幫助納米工程、生物工程、醫(yī)學、材料學等相關研究領域科學家獲得更多的發(fā)現。
（周煒）
