晝夜節(jié)律和睡眠穩(wěn)態(tài)是共同進(jìn)化而來的生物現(xiàn)象，前者控制人類何時入睡，后者控制每天要睡多久。在果蠅，小鼠和人類中，都能觀察到這兩種行為共同作用來控制動物的周期性睡眠。隨著近年來對各種模式生物的研究，科研人員對分別調(diào)控這兩種行為的分子和神經(jīng)通路了解得很多。但在大多數(shù)生物中，對節(jié)律神經(jīng)回路如何輸出到睡眠中心的連接機(jī)制依然未知。使得這成為睡眠領(lǐng)域的一個非常重要的問題。

近日浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院百人計劃郭方研究員，以果蠅為模式生物，鑒定出其腦中的背側(cè)晝夜節(jié)律神經(jīng)元APDN1往睡眠穩(wěn)態(tài)中心-橢球體EB-R2投射的神經(jīng)回路，并將相關(guān)成果發(fā)表在知名期刊《神經(jīng)元》（Neuron）上。研究揭示了該神經(jīng)回路決定睡眠和覺醒水平的作用機(jī)制，為闡述晝夜節(jié)律回路和睡眠回路的連接機(jī)制提供了非常重要的實驗依據(jù)。

這項科研工作的第一作者為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物系郭方研究員，郭方研究員和2017年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎獲得者、美國布蘭迪斯大學(xué)Michael Rosbash教授為本論文的共同通訊作者。

找到“開關(guān)”和“連接”

尋找兩者的關(guān)系，前提是有兩個實驗基礎(chǔ)，一個是郭方和導(dǎo)師Michael Rosbash之前就對有過明確的研究，果蠅的晝夜節(jié)律神經(jīng)元APDN1是控制睡眠穩(wěn)態(tài)的閥門，同時在2016年，約翰霍布金斯大學(xué)的科學(xué)家們已經(jīng)鑒定出果蠅中調(diào)控睡眠穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)元是橢球體EB-R2。

因此研究的主線就落到APDN1與橢球體EB-R2的關(guān)系上。

實驗中，郭方及其同事們發(fā)現(xiàn)果蠅的APDN1神經(jīng)元有兩簇投射，一簇向果蠅大腦前側(cè)，一簇向果蠅大腦后側(cè)。前期的研究中，科學(xué)家們關(guān)注的時候向后的這一簇，它起著抑制果蠅的活動的作用，該研究發(fā)現(xiàn)了果蠅節(jié)律神經(jīng)元控制睡眠的奧秘。

那么APDN1的前一簇往哪個腦區(qū)投射，生物學(xué)的功能是什么？

他們利用最新發(fā)明的神經(jīng)回路技術(shù)-跨突觸顯示技術(shù)，追蹤投射神經(jīng)元的走向。并通過膨脹顯微鏡（Expansion Microscopy）放大并透明化果蠅的大腦，發(fā)現(xiàn)這簇軸突往前投射到一個叫AOTU的腦區(qū)。鈣成像技術(shù)表明，它們支配著一群特殊的TuBu神經(jīng)元，并通過其與更高腦區(qū)域的睡眠穩(wěn)態(tài)中心-橢球體EB-R2偶聯(lián)。

最終郭方團(tuán)隊在形態(tài)學(xué)上鑒定出果蠅的背側(cè)節(jié)律神經(jīng)元APDN1往果蠅的睡眠穩(wěn)態(tài)中心與橢球體EB-R2投射的神經(jīng)回路。神經(jīng)元APDN1作為一個“開關(guān)”調(diào)控著EB-R2，激活APDN會在EB-R2中誘導(dǎo)出類似人類睡眠時的特定振蕩模式。

睡眠“防火墻”

已有的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人類進(jìn)入睡眠時會形成特定頻率振蕩的腦電波。那么，郭方通過鈣成像檢測到的果蠅調(diào)控睡眠腦區(qū)的高頻振蕩，會不會和在高等動物的一樣，起著睡眠時降低對外界反應(yīng)的作用？

在實驗中，郭方通過機(jī)械刺激偶聯(lián)光遺傳學(xué)實驗來證明自己的假設(shè)。當(dāng)果蠅睡眠時，他每隔半個小時都給果蠅一個機(jī)械振動，果蠅都會產(chǎn)生受激反應(yīng)，從睡眠中驚醒，呈現(xiàn)出規(guī)律性的高活動，然后再逐漸入睡。

第一個實驗，當(dāng)只激活APDN1神經(jīng)元時，大腦中振蕩波產(chǎn)生。果蠅在受到刺激后懶得動，醒來一下又迅速入睡。

第二個實驗，科研人員還通過光遺傳學(xué)的方式，激活DN1神經(jīng)元，果蠅進(jìn)入睡眠，再通過特定波長的綠光抑制EB-R2神經(jīng)元中的振蕩波。通過觀察果蠅的行為發(fā)現(xiàn)，受到刺激時果蠅會迅速反應(yīng)，顯著性的增加了高活動狀態(tài)，才重新進(jìn)入睡眠。

通過這些實驗，郭方發(fā)現(xiàn)，果蠅EB-R2中產(chǎn)生的特定振蕩模式是一道“防火墻”，可以”屏蔽”外界信息的輸入，讓果蠅對外界刺激不敏感?！疤囟X區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生某些頻率的共振，可能讓神經(jīng)元鎖定在某種狀態(tài)，使外界信息無法輸入?！惫秸f，“當(dāng)通過人為打破‘防火墻’，果蠅無法進(jìn)入深睡狀態(tài)。”

同時，郭方也告訴記者，目前尚待解決的科學(xué)問題是“防火墻”是如何導(dǎo)致外界信息無法傳入，這一神經(jīng)回路傳遞信號的遞質(zhì)是什么，具體內(nèi)部機(jī)制有待進(jìn)一步回答。

對這道睡眠“防火墻”的研究，還是一項起點性的工作。未來，可以通過藥物，治愈失眠，讓輕度睡眠患者擁有更好的睡眠質(zhì)量?？蒲腥藛T也猜想，隨著對深度睡眠機(jī)制研究的深入，或許以后充足的睡眠不需要8個小時以上，通過調(diào)控深度睡眠，在更快時間內(nèi)補(bǔ)充精力，睡眠2小時精神一整天也不無可能。“那時候，供人類自由支配的時間更長，不用在有限的覺醒，開啟‘倍速’人生?！?/span>

《神經(jīng)元》匿名評審專家們對這一研究結(jié)果也評價到：“該論文提供了（果蠅）生物鐘和睡眠調(diào)節(jié)之間目前最全面的聯(lián)系，并為理解高度保守的睡眠和晝夜節(jié)律整合的神經(jīng)機(jī)制提供了平臺。研究中應(yīng)用了最先進(jìn)的遺傳工具和實驗技術(shù)來繪制神經(jīng)回路。”“這一研究將對該領(lǐng)域產(chǎn)生巨大影響。”

 “果蠅”盒子

一位匿名專家指出，郭方團(tuán)隊的研究使用多種先進(jìn)的技術(shù)組合提供了令人信服的證據(jù)，證明了將晝夜節(jié)律神經(jīng)元連接到睡眠中心的神經(jīng)回路及其功能。那么他們是如何把這些技術(shù)更好的使用到實驗中呢？這就要提到郭方和他的同事們研發(fā)的“果蠅”盒子專利。

這個實驗盒，具有體積輕便，易于操作等優(yōu)點，利用攝像頭持續(xù)記錄96只果蠅的行為，能高通量的篩選調(diào)控果蠅行為的基因和神經(jīng)回路。

那么這個果蠅盒子是如何想到的呢？

這里先講一個“失眠的果蠅”故事。和Michael Rosbash教授同時獲得去年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎的Jeff Hall教授，70年代曾和同事在其導(dǎo)師Seymour Benzer教授的實驗室里，發(fā)現(xiàn)了一些“睡不好”的果蠅：其晝夜節(jié)律基因受到突變，很有個性的睡得早，醒得早。于是Seymour Benzer對這些果蠅產(chǎn)生了興趣，發(fā)明了的儀器來監(jiān)測其晝夜節(jié)律。

這個神奇的“果蠅”盒子，也是郭方在Rosbash教授實驗室里，某一天晚上熬夜做實驗，靈機(jī)一動想到的?！白钤绲脑褪?/span>2015年開始研制，現(xiàn)在已經(jīng)量產(chǎn)。不僅可以作為果蠅的實驗平臺，還可以用于記錄蚊子、斑馬魚等小型動物的行為。”郭方說。

郭方說，隨著相關(guān)實驗的引入，他們在這個果蠅盒子里，裝上了625nm的紅色LED和550nm的綠色LED，能快速對神經(jīng)元活性進(jìn)行雙向調(diào)控。同時也裝上了電磁閥控制的睡眠剝奪裝置，能定量的對果蠅進(jìn)行機(jī)械刺激，來檢測果蠅的覺醒閾值和睡眠深度。

目前課題組正在招聘技術(shù)員和博士后，歡迎神經(jīng)領(lǐng)域的有志之士和郭方研究員聯(lián)系gfang@zju.edu.cn。

（柯溢能）

論文鏈接:https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(18)30775-X