多細(xì)胞生物中不同細(xì)胞類(lèi)型共享相同的基因組，但由于基因的差異調(diào)控而形成高度特化的細(xì)胞功能。候選順式調(diào)控元件 (cCREs) 包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和絕緣子，通過(guò)提供轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的結(jié)合位點(diǎn)，在基因調(diào)控中起關(guān)鍵作用。通過(guò)解讀TFs及其相應(yīng)cCREs在物種間的保守基因組調(diào)控模式，可以深入了解細(xì)胞類(lèi)型演化。盡管已有工作通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single cell RNA-seq，scRNA-seq）識(shí)別了多個(gè)物種的細(xì)胞特異TFs，但低表達(dá)水平的TFs的檢測(cè)仍受技術(shù)和成本限制，并且限制了TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的探索。單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序 （single cell ATAC-seq，scATAC-seq）可以提供與轉(zhuǎn)錄組互補(bǔ)的表觀調(diào)控信息，有助于我們更為深刻地理解跨物種的保守調(diào)控機(jī)制。人、小鼠的全身多組織染色質(zhì)可及性景觀已經(jīng)相繼問(wèn)世，但其它模式生物如斑馬魚(yú)、果蠅和蚯蚓仍缺乏全身染色質(zhì)可及性景觀。

  2024年2月8日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/良渚實(shí)驗(yàn)室郭國(guó)驥教授團(tuán)隊(duì)在Development Cell上在線發(fā)表了題為“Construction of Single-Cell Cross-Species Chromatin Accessibility Landscapes with combinatorial-hybridization-based ATAC-seq”的研究論文，開(kāi)發(fā)了一種基于組合雜交的高通量、低成本、高信噪比的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序技術(shù)CH-ATAC-seq，構(gòu)建了低等物種包括斑馬魚(yú)，果蠅，蚯蚓的全身染色質(zhì)可及性景觀，并闡述了跨物種基因和調(diào)控元件的保守和多樣性特征。

CH-ATAC-seq是一種基于組合雜交的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性技術(shù)。首先，細(xì)胞核在4個(gè)96孔板內(nèi)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)座反應(yīng)打上第一輪共384種標(biāo)簽。然后，細(xì)胞核被收集混勻并均勻分布到新的96孔板進(jìn)行雜交反應(yīng)，并引入第二輪共768種標(biāo)簽。最后，細(xì)胞核再次收集并分布到96孔板進(jìn)行PCR反應(yīng)，引入最后一輪共384種標(biāo)簽。理論上，單次實(shí)驗(yàn)可以處理百萬(wàn)級(jí)別的細(xì)胞核，并且多個(gè)樣本可以進(jìn)行通過(guò)第一輪標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記后混到一起處理，大大減少了樣本間的批次效應(yīng)（圖1）。本研究生成了基于CH-ATAC-seq平臺(tái)的小鼠數(shù)據(jù)，并與已發(fā)表的sci-ATAC-seq的小鼠腎臟數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CH-ATAC-seq具有明顯更高的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）富集分?jǐn)?shù)，表明CH-ATAC-seq數(shù)據(jù)具有更高的信噪比。

CH-ATAC-seq實(shí)驗(yàn)原理流程

基于CH-ATAC-seq測(cè)序平臺(tái)，本研究構(gòu)建了成年斑馬魚(yú)、果蠅、蚯蚓的全身染色質(zhì)可及性景觀，總共得到~550000高質(zhì)量細(xì)胞核。為了驗(yàn)證細(xì)胞類(lèi)型注釋的準(zhǔn)確性，利用相同物種的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)簽轉(zhuǎn)移。最后，分別對(duì)每個(gè)物種的差異peak富集，利用HOMER工具進(jìn)行了motif的從頭富集。結(jié)果顯示，富集到的motif能較好地對(duì)應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型特異功能。

為了系統(tǒng)性地進(jìn)行跨物種細(xì)胞類(lèi)型的比較分析，本研究收集了已發(fā)表的人、猴和小鼠的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性景觀數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了上游的數(shù)據(jù)統(tǒng)一處理，最終得到了152種主要細(xì)胞類(lèi)型以及約80萬(wàn)個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異的cCREs。隨后，以人的基因組為參考，基于liftOver工具，將小鼠和斑馬魚(yú)的peak進(jìn)行分類(lèi)，包括：序列水平上無(wú)法與人基因組的區(qū)域?qū)R的UA元件；可以對(duì)齊到人基因但并非在兩個(gè)物種都開(kāi)放的A元件；以及既序列保守又在兩個(gè)物種中同時(shí)開(kāi)放的CA元件。CA元件被認(rèn)為是序列和功能同時(shí)物種間保守的調(diào)控元件，具有顯著更高的Phylop保守分?jǐn)?shù)，并且這些元件高度富集在TSS區(qū)域。表明啟動(dòng)子序列在細(xì)胞類(lèi)型的進(jìn)化中具有更高的選擇壓力，從而保留細(xì)胞類(lèi)型特異的功能。 

隨后，基于SAMap算法，本研究對(duì)6個(gè)物種的染色質(zhì)可及性圖譜進(jìn)行了跨物種分析，結(jié)果表明神經(jīng)和肌肉細(xì)胞展示了物種間高度保守性。另外，在細(xì)胞譜系水平上通過(guò)分析跨物種保守的TFs，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞顯示出了明顯的組織特異性。

最后，結(jié)合6個(gè)物種的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，作者利用SENIC+進(jìn)行了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)，鑒定出了譜系特異TF以及對(duì)應(yīng)的TF靶向區(qū)域和TF靶向基因。與TF靶向區(qū)域相比，TF靶向基因具有相對(duì)高的保守程度。值得一提的是，雖然不同物種的TF靶向基因保守程度不高，但它們都能富集到細(xì)胞類(lèi)型特異的功能。

總的來(lái)說(shuō)，本研究開(kāi)發(fā)了新一代的染色質(zhì)可及性技術(shù)——CH-ATAC-seq，并通過(guò)在物種層面上首次構(gòu)建跨物種染色質(zhì)可及性分析，深入了對(duì)細(xì)胞類(lèi)型的保守性和多樣性的理解（圖2）。此外，本研究為遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)提供了寶貴數(shù)據(jù)資源和研究途徑。

分析流程圖

浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士生張國(guó)棟、博士生傅雨婷、博士生楊蕾、博士后葉昉和博士后張?chǎng)?/span>為本文共同第一作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/良渚實(shí)驗(yàn)室郭國(guó)驥教授、良渚實(shí)驗(yàn)室王晶晶研究員、浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院韓曉平教授為本文的通訊作者。本研究獲得了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家創(chuàng)新團(tuán)體計(jì)劃的支持。