腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system; ENS）是神經(jīng)元胞體位于腸內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)，可獨(dú)立于大腦發(fā)揮作用，被稱(chēng)為人體“第二大腦”，即“腸腦”。人體ENS由約5億個(gè)神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元與腸內(nèi)免疫細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、血管及平滑肌相互作用以維持腸道功能。同時(shí)，ENS也通過(guò)周?chē)窠?jīng)（內(nèi)臟感覺(jué)、交感和副交感神經(jīng)）同大腦聯(lián)系，形成腦-腸軸雙向神經(jīng)傳導(dǎo)通路。最近研究發(fā)現(xiàn)ENS與腸內(nèi)菌群互動(dòng)參與帕金森氏病、自閉癥和抑郁癥等精神疾病發(fā)生與發(fā)展。確定ENS胚胎學(xué)來(lái)源并揭示其發(fā)育調(diào)控機(jī)制有助于了解ENS功能并為ENS相關(guān)腸道和精神疾病的機(jī)制研究提供理論支持。

ENS來(lái)源于神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells; NCCs）。NCCs為一群產(chǎn)生于神經(jīng)管背側(cè)多潛能細(xì)胞，依據(jù)其形成神經(jīng)管位置分為四個(gè)亞群，每一亞群可遷移至身體不同位置形成不同類(lèi)型細(xì)胞（圖 1）?，F(xiàn)今領(lǐng)域內(nèi)對(duì)于ENS胚胎學(xué)來(lái)源的共識(shí)是：迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞（vNCCs）進(jìn)入食管后沿腸道由近側(cè)端向遠(yuǎn)側(cè)端遷移形成絕大部分ENS，骶神經(jīng)嵴細(xì)胞（sNCCs）自骶部神經(jīng)管遷移進(jìn)入末端結(jié)腸后由遠(yuǎn)側(cè)端向近側(cè)端遷移對(duì)結(jié)腸ENS有所貢獻(xiàn)（圖1）。先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease; HD）是一種臨床常見(jiàn)新生兒疾病，發(fā)病率為1/2000～1/5000，病理特點(diǎn)為vNCCs沿腸道遷移障礙導(dǎo)致的遠(yuǎn)端腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失（圖1）。sNCCs對(duì)ENS貢獻(xiàn)理論無(wú)法解釋HD病理特點(diǎn)，因而對(duì)人們理解HD發(fā)病機(jī)制造成極大困擾。同時(shí)，斑馬魚(yú)的研究結(jié)果揭示sNCCs對(duì)ENS沒(méi)有貢獻(xiàn)，人體sNCCs對(duì)ENS貢獻(xiàn)的證據(jù)也是缺乏。因此，提供可信實(shí)驗(yàn)證據(jù)以確定sNCCs對(duì)ENS貢獻(xiàn)與否極為必要。

圖1 課題背景：左圖修改自Nature Reviews Neuroscience 2007,8:466-479，中圖和右圖由王良課題組提供 

2024年3月5日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖和組織胚胎學(xué)系、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、雙腦中心王良課題組聯(lián)合德國(guó)亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院Till Marquardt課題組，在消化領(lǐng)域國(guó)際重要期刊Gastroenterology上發(fā)表了題為“Sacral neural crest-independent origin of the enteric nervous system in mouse”的最新研究成果。該項(xiàng)研究通過(guò)構(gòu)建基因編輯小鼠對(duì)vNCCs和sNCCs進(jìn)行譜系追蹤，結(jié)合三維重建和體外共培養(yǎng)等研究方法，揭示sNCCs對(duì)ENS沒(méi)有貢獻(xiàn)。研究成果理清了關(guān)于ENS胚胎學(xué)來(lái)源的爭(zhēng)議，為理解ENS發(fā)育機(jī)制及ENS相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制奠定了一定理論基礎(chǔ)。

 sNCCs對(duì)ENS有所貢獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自三方面：

1）通過(guò)在早期雞和小鼠胚胎的神經(jīng)管內(nèi)注射示蹤劑標(biāo)記sNCCs后，在經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的胚胎的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了標(biāo)記細(xì)胞。但是該實(shí)驗(yàn)方法存在特異性差的缺陷，即示蹤劑可能同時(shí)標(biāo)記神經(jīng)管內(nèi)外的非sNCCs細(xì)胞；2）利用NCC標(biāo)記物進(jìn)行免疫染色發(fā)現(xiàn)結(jié)腸內(nèi)存在非vNCCs細(xì)胞。同樣該實(shí)驗(yàn)方法無(wú)法證明這些細(xì)胞來(lái)自骶神經(jīng)管；3）通過(guò)雞-鵪鶉神經(jīng)管移植實(shí)驗(yàn)或者小鼠盆腔神經(jīng)節(jié)結(jié)腸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)存在sNCCs。由于這些實(shí)驗(yàn)操作改變了sNCCs正常的體內(nèi)遷移環(huán)境，因此極有可能改變了sNCCs遷移特性。為了彌補(bǔ)上述實(shí)驗(yàn)方法缺陷，研究人員首先利用sNCCs的遷移特點(diǎn)及Wnt1基因的表達(dá)特點(diǎn)，構(gòu)建Wnt1^DreERT2；H11^RSRYFP小鼠對(duì)sNCCs進(jìn)行譜系追蹤發(fā)現(xiàn)sNCCs沒(méi)有遷移進(jìn)入腸道，得出sNCCs對(duì)ENS沒(méi)有貢獻(xiàn)的初步結(jié)論。隨后，科研人員構(gòu)建了針對(duì)vNCCs的Sox10^CreERT2；Phox2b^FLP；Ai65譜系追蹤小鼠，并將此小鼠同Wnt1^DreERT2；H11^RSRYFP小鼠交配進(jìn)一步構(gòu)建Wnt1^DreERT2；Phox2b^FLP；Sox10^CreERT2；H11^RSRYFP；Ai65，即WPS小鼠。WPS孕鼠接受Tamoxifen注射后，胚胎體內(nèi)sNCCs通過(guò)Dre-Rox基因重組被YFP標(biāo)記，vNCCs通過(guò)FLP-FRT和Cre-loxp基因雙重組被TOM標(biāo)記，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)sNCCs和vNCCs同時(shí)標(biāo)記。WPS小鼠譜系追蹤結(jié)果表明，sNCCs沒(méi)有遷移進(jìn)入腸道，vNCCs為ENS唯一胚胎學(xué)來(lái)源（圖2）。

圖2 sNCCs對(duì)ENS沒(méi)有貢獻(xiàn)

綜上，該項(xiàng)研究成果通過(guò)修正ENS發(fā)育模式（圖3），理清半個(gè)多世紀(jì)來(lái)關(guān)于ENS胚胎學(xué)來(lái)源的爭(zhēng)議，在完善ENS發(fā)育理論同時(shí)也為理解先天性巨結(jié)腸發(fā)病機(jī)制提供了新的洞見(jiàn)。同時(shí)，由于一些課題組已經(jīng)開(kāi)始探索以sNCCs為靶細(xì)胞的先天性巨結(jié)腸治療策略，研究成果將有助于鎖定vNCCs為ENS發(fā)育缺陷疾病的治療靶標(biāo)細(xì)胞，因而對(duì)ENS發(fā)育缺陷疾病的治療具有一定指導(dǎo)作用。

圖3 腸神經(jīng)胚胎學(xué)來(lái)源發(fā)育模式修正圖

王良課題組余琦博士（現(xiàn)為浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院博士后）、劉莉博士（現(xiàn)為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院博士后）、杜夢(mèng)潔博士（現(xiàn)為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科主管技師）為本文共同第一作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王良長(zhǎng)聘副教授主導(dǎo)了這項(xiàng)研究，為論文最后通訊作者。德國(guó)亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院Till Marquardt教授為論文共同通訊作者。本研究獲得國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目和浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助。王良課題組博士生辛?xí)札埡皖櫰G蘭及Till Marquardt課題組Daniel Muller博士參與課題并作出一定貢獻(xiàn)。該項(xiàng)工作獲得浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院谷巖教授、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院高志剛主任醫(yī)師及復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院何苗研究員的大力支持。課題組感謝浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)方三華老師提供的技術(shù)支持及上海南方模式生物有限公司協(xié)助制備基因編輯小鼠。

王良，浙江大學(xué)長(zhǎng)聘副教授，博士生導(dǎo)師，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院雙聘教授，系統(tǒng)醫(yī)學(xué)中心和雙腦中心獨(dú)立研究員。課題組研究方向?yàn)橹車(chē)窠?jīng)，重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)臟神經(jīng)（內(nèi)臟感覺(jué)、交感和副交感神經(jīng)）、腸神經(jīng)和內(nèi)臟施旺細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制及相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制，長(zhǎng)期目標(biāo)為周?chē)窠?jīng)疾病的臨床治療提供相關(guān)的理論指導(dǎo)。近年來(lái)作為最后通訊作者在Gastroenterology、CMGH和Journal of Neuroscience雜志上發(fā)表多篇論文。王良課題組長(zhǎng)期歡迎研究生報(bào)考和博士后應(yīng)聘，歡迎有醫(yī)學(xué)和生物學(xué)背景且對(duì)周?chē)窠?jīng)發(fā)育具有濃厚興趣的人員聯(lián)系咨詢(xún)，有意向可發(fā)送簡(jiǎn)歷至lwang1@zju.edu.cn。