單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析（single cell ATAC-seq，scATAC-seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（single cell RNA-seq，scRNA-seq）測(cè)序是單細(xì)胞多組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的兩個(gè)組學(xué)技術(shù)。主流的微流控體系和微孔板體系為高通量的單細(xì)胞或單細(xì)胞核分離提供了有效的方案。但微流控平臺(tái)的封閉特性使得單細(xì)胞分隔之后很難再對(duì)其進(jìn)行多步加樣或其他操作，一些復(fù)雜步驟的組學(xué)技術(shù)體系較難在微流控體系內(nèi)展開(kāi)。開(kāi)放式的pool-split方法能夠靈活兼容不同單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)，但在多輪混合-分散步驟中仍會(huì)有相當(dāng)比例的細(xì)胞損失，與微流控體系類(lèi)似，這些技術(shù)路線對(duì)細(xì)胞的起始量需求也比較高，難以處理珍貴樣本與細(xì)胞/細(xì)胞核得率低的物種或組織。而微孔板體系的半開(kāi)放，低成本，高捕獲效率，兼容自動(dòng)化操作等特性，能夠解決從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用到轉(zhuǎn)化應(yīng)用面臨的一系列問(wèn)題。

  2024年3月26日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/良渚實(shí)驗(yàn)室郭國(guó)驥教授團(tuán)隊(duì)在Cell Discovery在線發(fā)表了題為“Fast and flexible profiling of chromatin accessibility and total RNA expression in single nuclei using Microwell-seq3”的研究論文，發(fā)布了新一代低成本、高通量、高兼容性的微孔板平臺(tái)（Microwell-seq3）來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞中的總RNA表達(dá)與染色質(zhì)開(kāi)放性，系統(tǒng)比較了該技術(shù)在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組范圍及染色質(zhì)可及性靈敏度提升的情況下，對(duì)小鼠多種組織細(xì)胞類(lèi)型的兼容性，并展示了其快速鑒定衰老自發(fā)腫瘤中惡性細(xì)胞的應(yīng)用場(chǎng)景。

  郭國(guó)驥教授團(tuán)隊(duì)自2018年以來(lái)先后報(bào)道了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微孔高通量單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)Microwell-seq及Microwell-seq2.0。在此基礎(chǔ)上，Microwell-seq3結(jié)合了組合標(biāo)記策略和兼容自動(dòng)化加樣的雙通結(jié)構(gòu)微孔芯片，在小試管中即可快速完成大量單細(xì)胞核的文庫(kù)構(gòu)建操作。單細(xì)胞核的處理使該技術(shù)能夠兼容新鮮及凍存組織，在轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建的流程中，Microwell-seq3采用隨機(jī)引物捕獲細(xì)胞內(nèi)包括mRNA，lncRNA在內(nèi)的各種編碼，非編碼與小RNA。細(xì)胞核在進(jìn)行原位逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或Tn5轉(zhuǎn)座酶之后，接著將處理后的細(xì)胞核和微珠充分混合并轉(zhuǎn)移至試管內(nèi)的微孔芯片中（圖1）。Microwell-seq3使用的雙通可穿透孔微孔芯片并不完全依賴(lài)重力和泊松分布，而是通過(guò)毛細(xì)作用均勻的捕獲流經(jīng)表面含有細(xì)胞核與微珠的液體，避免了細(xì)胞的浪費(fèi)。置于PCR管中的微孔芯片，每一輪反應(yīng)都可在需要的溫度下孵育，而芯片表面的油封可有效防止擴(kuò)增步驟中可能出現(xiàn)的交叉污染。通過(guò)后續(xù)數(shù)據(jù)分析可區(qū)分并解碼含有多個(gè)微珠或多個(gè)細(xì)胞核的微孔。

圖1 Microwell-seq3實(shí)驗(yàn)原理流程及數(shù)據(jù)質(zhì)控

Microwell-seq3人鼠混合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（TSS）和轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)周?chē)淖x取信號(hào)和其他方法具有相似的區(qū)域富集特征。snRNA-seq的結(jié)果顯示，Microwell-seq3的基因檢測(cè)能力有所提高，且表現(xiàn)出很好的轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)覆蓋。此外，Microwell-seq3檢測(cè)數(shù)據(jù)中除編碼RNA外，還含有9.3%的lncRNA。研究者進(jìn)一步收集了多種成年小鼠組織，通過(guò)Microwell-seq3生成了單細(xì)胞總RNA與染色質(zhì)可及性圖譜。涵蓋了各組織中的主要細(xì)胞類(lèi)型，并聯(lián)合RNA-seq與ATAC-seq基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，富集了大腦中主要細(xì)胞類(lèi)型中的調(diào)控因子，提示結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比單一轉(zhuǎn)錄組層面能夠提供更多信息。成年小鼠細(xì)胞總RNA與染色質(zhì)開(kāi)放圖譜的繪制也展示了Microwell-seq3的優(yōu)秀性能以及對(duì)各組織類(lèi)型細(xì)胞的兼容性。

為探索Microwell-seq3在輔助臨床診斷上的應(yīng)用，研究嘗試通過(guò)Microwell-seq3鑒定老年小鼠自發(fā)性肺部腫瘤中的惡性細(xì)胞。染色質(zhì)可及性分析整合了肺腫瘤、腫瘤鄰近組織及正常肺組織的數(shù)據(jù)，揭示包括常規(guī)肺泡I型細(xì)胞、II型細(xì)胞、Clara細(xì)胞、間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞以及免疫細(xì)胞亞型。同時(shí)也鑒定到一群特征介于肺泡上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間的腫瘤惡性上皮細(xì)胞，而通過(guò)拷貝數(shù)變異（CNV）預(yù)測(cè)提示該群惡性細(xì)胞存大量拷貝數(shù)變異模式，具有較高的腫瘤突變負(fù)荷。腫瘤特異性細(xì)胞亞群中的ATAC-seq信號(hào)顯示在特定染色體區(qū)域拷貝數(shù)擴(kuò)增或缺失的惡性細(xì)胞在腫瘤和腫瘤鄰近組織中富集。通過(guò)SCRIP分析富集惡性細(xì)胞中激活的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）及其調(diào)控的靶基因網(wǎng)絡(luò)表明，腫瘤和腫瘤鄰近組織的細(xì)胞表現(xiàn)出Foxc2（調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程）、Nkx3-1（調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中移行惡性上皮細(xì)胞的細(xì)胞干性）、Foxm1、Nkx2-1、Tp63和Zeb1的高調(diào)控活性，而Trp53在正常組織中的調(diào)控活性相對(duì)較高。以上結(jié)果表明自發(fā)性肺腫瘤中的惡性上皮細(xì)胞表現(xiàn)出一定干性特征，以及介于間充質(zhì)細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞之間明確的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)渡狀態(tài)，Trp63，Nkx2-1和Ki67等靶點(diǎn)的富集也提示該肺部腫瘤結(jié)節(jié)明確符合肺腺鱗癌的分子特征，部分調(diào)控基因也在免疫組化中得到了驗(yàn)證，證實(shí)該方法在能輔助腫瘤病理診斷的情況下，在單細(xì)胞基因調(diào)控層面提供更多的惡性細(xì)胞潛在靶點(diǎn)信息及其互作模式（圖2）。

圖2 老年小鼠自發(fā)性肺腫瘤分析

總的來(lái)說(shuō)，本研究開(kāi)發(fā)了新一代微孔板單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)——Microwell-seq3，證實(shí)了其在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)開(kāi)放性層面對(duì)各類(lèi)組織細(xì)胞的兼容性，驗(yàn)證了其在腫瘤惡性細(xì)胞鑒定中的應(yīng)用，在單細(xì)胞水平為基因檢測(cè)和調(diào)控靶點(diǎn)富集提供輔助信息。同時(shí)該技術(shù)平臺(tái)的自動(dòng)化兼容性也使得技術(shù)轉(zhuǎn)化成為可能。

浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士后葉昉，博士生張爽、博士生傅雨婷、博士生楊蕾、博士生張國(guó)棟和浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院鄔一軍主任醫(yī)師為本文共同第一作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/良渚實(shí)驗(yàn)室郭國(guó)驥教授為本文的通訊作者。本研究獲得了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家基金委創(chuàng)新群體項(xiàng)目的支持。