RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是一種保守的轉(zhuǎn)錄后修飾，廣泛分布在rRNA、tRNA和mRNA上。mRNA上的m5C修飾主要由NSUN2和NSUN6等甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生，并且可以被TET家族蛋白和ALKBH1進(jìn)一步氧化到hm5C，f5C和ca5C。RNA m5C修飾可以被特定的結(jié)合蛋白所識別進(jìn)而參與基因表達(dá)調(diào)控，如近年來國家生物信息中心楊運桂團(tuán)隊在RNA m5C修飾研究中取得了系列突破性成果，報道了包括ALYREF, YBX1, YBX2和SRSF2在內(nèi)的多個結(jié)合蛋白及其調(diào)控功能，極大地推動了對于RNA m5C修飾生物學(xué)功能的理解。
對于RNA m5C修飾功能的探究依賴于靈敏精準(zhǔn)的檢測技術(shù)。目前RNA m5C修飾檢測主要依賴于亞硫酸氫鹽測序（bisulfite sequencing，BS-seq），在BS-seq中未修飾的胞嘧啶（C）被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ?/span>U），而m5C保持不變，因此通過檢測未轉(zhuǎn)變C即可實現(xiàn)對于m5C修飾的鑒定。雖然BS-seq操作簡單便捷，并且可以實現(xiàn)單堿基分辨率m5C修飾的定量檢測，但是其存在三個主要不足之處：1）間接檢測m5C，依賴于未修飾C的高效轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換不完全可能會導(dǎo)致假陽性；2）反應(yīng)條件苛刻，導(dǎo)致RNA降解，限制低起始量樣本和低豐度RNA的檢測；3）C轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>U后序列復(fù)雜度降低，影響比對準(zhǔn)確度，限制低序列復(fù)雜度RNA 上m5C的檢測。盡管一系列優(yōu)化措施如使用ACT三元堿基隨機(jī)引物提高檢測精準(zhǔn)度與靈敏度、優(yōu)化分析流程、利用無修飾RNA文庫校正和 Ultrafast BS反應(yīng)條件提高轉(zhuǎn)換效率等，顯著提升了BS-seq的檢測精準(zhǔn)度，但由于mRNA m5C修飾水平較低（中位數(shù)約為20%以下），對于依賴間接檢測的BS-seq，低復(fù)雜度序列以及低修飾比例位點的靈敏檢測仍是挑戰(zhàn)。雖然目前已有多種不依賴亞硫酸氫鹽的RNA m5C檢測方法被報道，但是這些方法各有局限，均無法實現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組水平RNA m5C修飾單堿基分辨率無偏檢測。
2024年7月12日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李笑雨研究員聯(lián)合北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院伊成器教授在Molecular Cell發(fā)表了題為Base-resolution m5C profiling across the mammalian transcriptome by bisulfite-free enzyme-assisted chemical labeling approach的研究論文，該研究開發(fā)了一種不依賴于亞硫酸氫鹽的檢測新技術(shù)，m5C-TAC-seq（m5C detection strategy enabled by TET-assisted chemical labeling），實現(xiàn)了全轉(zhuǎn)錄組水平m5C位點單堿基分辨率的精準(zhǔn)、靈敏檢測。
這項技術(shù)的核心原理是將酶促反應(yīng)與化學(xué)標(biāo)記相結(jié)合，利用優(yōu)化后的TET酶促反應(yīng)將RNA m5C氧化至f5C，進(jìn)一步使用疊氮茚二酮（AI）對于氧化產(chǎn)生的f5C進(jìn)行特異性標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物不僅可以產(chǎn)生C-to-T的轉(zhuǎn)變，并且還可以通過點擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行富集，從而實現(xiàn)對于m5C修飾單堿基分辨率的直接檢測（圖1A）。這一直接檢測的特性使其能夠靈敏檢測修飾比例低至2.5%的位點（圖1B）。此外該方法還具有反應(yīng)條件溫和、不影響轉(zhuǎn)錄組堿基組成的特點，因此可以應(yīng)用于低豐度和低序列復(fù)雜度的轉(zhuǎn)錄本。同時，結(jié)合multiplexing文庫構(gòu)建策略，不僅可以減少樣品之間的技術(shù)誤差，并且能夠?qū)崿F(xiàn)m5C修飾的半定量檢測。
圖1：m5C-TAC-seq可以實現(xiàn)單堿基分辨率m5C位點檢測。A. m5C-TAC-seq原理及流程圖；B. m5C-TAC-seq計算的C-to-T轉(zhuǎn)化率與m5C修飾比例呈現(xiàn)正相關(guān)；C. m5C-TAC-seq可以實現(xiàn)對于rRNA已知位點與未知位點的靈敏檢測；D. 未修飾HeLa轉(zhuǎn)錄組文庫對照分析提示2,499個m5C位點中只有6個位假陽性位點；E. 四元堿基組成大大提高了比對準(zhǔn)確度；F. caRNA上m5C修飾位點分布。
為了評估m5C-TAC-seq的靈敏性和準(zhǔn)確性，研究人員首先將其應(yīng)用于rRNA和tRNA上。在rRNA上，m5C-TAC-seq不僅能夠精準(zhǔn)檢測已知的高m5C修飾位點，并且還鑒定了一個新的低修飾位點m5C3683及其修飾酶（圖1C），驗證了m5C-TAC-seq的靈敏度。此外，對于具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)且序列復(fù)雜度較低的tRNA，m5C-TAC-seq不僅能夠鑒定所有已報道位點及其修飾酶，并且由于保留了四元堿基組成使得其可以實現(xiàn)對不同tRNA isodecoder的精準(zhǔn)檢測。利用m5C-TAC-seq，研究人員繪制了HeLa、HEK293T和mESC的單堿基分辨率m5C修飾圖譜，分別鑒定了2499、765和664個m5C位點，并利用無修飾轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行對照分析驗證了這些位點的可靠性（圖1D）。更為重要的是，鑒定了絕大多數(shù)m5C位點的甲基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)一步確認(rèn)了這些位點的準(zhǔn)確性。此外，與BS-seq相比，m5C-TAC-seq在低修飾位點的檢測上也表現(xiàn)出高精度和高靈敏度，提示其直接檢測策略的魯棒性。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，除了已知的NSUN2和NSUN6，rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN5也可以作用于mRNA，這一發(fā)現(xiàn)與近期中山大學(xué)張銳團(tuán)隊開發(fā)的高靈敏motif分析工具iMVP在mRNA上鑒定到的NSUN5 motif一致【10】。此外，利用m5C-TAC-seq，研究人員還發(fā)現(xiàn)在mESC的分化過程中，大部分mRNA上m5C位點呈現(xiàn)甲基化水平下調(diào)趨勢，并且富集在細(xì)胞周期及細(xì)胞分裂相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄本上，提示了m5C修飾可能參與到mESC分化過程中。得益于溫和的反應(yīng)條件及對堿基組成的保留（圖1E），m5C-TAC-seq實現(xiàn)了對含有大量低復(fù)雜度序列的chromatin-associated RNA（caRNA）上m5C位點的鑒定（圖1F），提示了四元堿基的保留對于低復(fù)雜度序列上m5C修飾檢測的重要性。
綜上所述，該研究開發(fā)了直接檢測m5C修飾的新技術(shù)m5C-TAC-seq，并展示了m5C-TAC-seq技術(shù)高靈敏、高精準(zhǔn)的檢測特性。m5C-TAC-seq不僅可以應(yīng)用于包括低豐度、低序列復(fù)雜度在內(nèi)的多種類型RNA和低修飾比例m5C位點的檢測，并且可以實現(xiàn)在多種生物學(xué)過程中m5C修飾的動態(tài)檢測，將有助于理解和推動RNA m5C修飾生物學(xué)功能的探究。
圖2：m5C-TAC-seq可以應(yīng)用于多種類型RNA以及生物學(xué)過程中m5C修飾位點的動態(tài)檢測。
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生盧亮、北京大學(xué)生科院張曉婷博士、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院周悅南博士和施佐堃博士為共同第一作者。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院李笑雨研究員和北京大學(xué)伊成器教授為本論文的共同通訊作者。浙江大學(xué)王青青教授、尹亞飛研究員、熊旭深研究員和馮鈺研究員，中山大學(xué)楊建華教授，國家生物信息中心楊瑩研究員和山東大學(xué)孫磊研究員對本研究提供了重要的幫助和討論支持。
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院李笑雨研究員主要研究方向為RNA修飾檢測技術(shù)的開發(fā)及小非編碼RNA上修飾功能的探究，常年招收博士后和科研助理，歡迎有興趣的同學(xué)投遞簡歷，課題組主頁：https://person.zju.edu.cn/lixiaoyu
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.06.021
