2024年8月23日，生研院朱永群教授實(shí)驗(yàn)室和生科院周艷研究員實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合在Cell Research雜志在線發(fā)表了題為“Structural basis of the bacterial flagellar motor rotational switching”的研究論文，通過構(gòu)建激活型趨化因子蛋白CheY突變體，純化來源于病原菌沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）的內(nèi)源性的、含方向開關(guān)復(fù)合物胞質(zhì)環(huán)（C ring）的鞭毛馬達(dá)顆粒，解析了分別處于逆時(shí)針和順時(shí)針旋轉(zhuǎn)方向中的、完整的鞭毛馬達(dá)-接頭裝置復(fù)合物的兩個(gè)高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，清晰地揭示了CheY蛋白結(jié)合導(dǎo)致方向開關(guān)復(fù)合物的構(gòu)象變化，提出了鞭毛馬達(dá)定子單元的內(nèi)膜重定位概念，從而闡明了細(xì)菌鞭毛馬達(dá)旋轉(zhuǎn)方向轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，糾正了之前所有關(guān)于C ring的組裝和結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤理解，向人們展示了完整的細(xì)菌鞭毛馬達(dá)的結(jié)構(gòu)及工作原理。
細(xì)菌鞭毛基本結(jié)構(gòu)包括鞭毛絲（filament）、接頭裝置（hook）以及鞭毛馬達(dá)（flagellar motor）三部分。鞭毛馬達(dá)是由鑲嵌在細(xì)菌細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)子（rotor）及其周圍錨定的定子單元（stator units）組合而成。定子單元是一種離子通道，可以利用細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外的離子電化學(xué)梯度即離子動(dòng)力勢(shì)促使定子單元發(fā)生旋轉(zhuǎn)，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能來產(chǎn)生扭矩，扭矩經(jīng)轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)中位于胞質(zhì)一側(cè)的胞質(zhì)環(huán)（cytoplasmic ring，C ring）傳遞到聯(lián)動(dòng)桿，再進(jìn)而傳遞給接頭裝置和遠(yuǎn)端鞭毛絲，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)。
細(xì)菌鞭毛馬達(dá)是一個(gè)巨大的能雙向旋轉(zhuǎn)的分子馬達(dá)，通賦予了細(xì)菌超級(jí)運(yùn)動(dòng)能力，能驅(qū)使細(xì)菌每秒鐘游動(dòng)長(zhǎng)達(dá)自己身長(zhǎng)幾十倍、甚至上百倍的距離。不僅如此，細(xì)菌鞭毛馬達(dá)能在逆時(shí)針和順時(shí)針旋轉(zhuǎn)方向之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。正常情況下鞭毛逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，細(xì)菌向前游動(dòng)。當(dāng)趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CheY蛋白會(huì)被磷酸化，磷酸化的CheY（CheY-P）通過結(jié)合到C ring，促使鞭毛馬達(dá)旋轉(zhuǎn)方向從逆時(shí)針（CCW）轉(zhuǎn)換為順時(shí)針（CW）方向，最終改變菌體運(yùn)動(dòng)方向，因此C ring也被稱為方向開關(guān)復(fù)合物（switch complex）。此外，CheZ可以將CheY-P去磷酸化進(jìn)而反調(diào)控馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)方向。由于C ring結(jié)構(gòu)高度動(dòng)態(tài)且在內(nèi)源性純化時(shí)容易從鞭毛馬達(dá)上解聚，因此聚焦于C ring的鞭毛馬達(dá)旋轉(zhuǎn)方向調(diào)控的結(jié)構(gòu)機(jī)制研究一直存在不少的障礙，導(dǎo)致細(xì)菌鞭毛馬達(dá)旋轉(zhuǎn)方向轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制長(zhǎng)期不清楚，是領(lǐng)域內(nèi)長(zhǎng)期懸而未決的重要問題之一。
浙江大學(xué)朱永群課題組近年來一直研究細(xì)菌鞭毛馬達(dá)工作機(jī)制，不斷優(yōu)化沙門氏菌內(nèi)源性鞭毛馬達(dá)純化體系，通過構(gòu)建激活型CheY突變體（CheY**，即CheYD13K&Y106W突變體），成功獲得了逆時(shí)針和順時(shí)針旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下沙門氏菌含C ring的完整鞭毛馬達(dá)-接頭裝置復(fù)合物顆粒，并解析了它們的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖1）。含CCW-C ring的鞭毛馬達(dá)-接頭裝置復(fù)合物結(jié)構(gòu)共包含341個(gè)亞基，由15種不同鞭毛蛋白組成，整體分子量約為10.2MDa，高度約為680?。而含CheY**結(jié)合的CW-C ring的鞭毛馬達(dá)-接頭裝置復(fù)合物整個(gè)模型由375個(gè)亞基組成，高度約為664?。兩種旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下的C ring均具有C34對(duì)稱性，由34個(gè)FliG、34個(gè)FliM和102個(gè)FliN以1:1:3的摩爾比例組成，內(nèi)部具有廣泛且獨(dú)特的亞基間的交叉互作，可分為內(nèi)部亞環(huán)、上部亞環(huán)、中間亞環(huán)和底部亞環(huán)共計(jì)四個(gè)亞環(huán)。其中，FliG通過堆積致其C端結(jié)構(gòu)域FliGCC排列形成了可以與定子單元互作的上部亞環(huán)結(jié)構(gòu)。CheY**的結(jié)合導(dǎo)致了C ring的整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的傾斜和向內(nèi)收縮，并向MS ring和細(xì)菌內(nèi)膜靠近16 ?的距離（圖1）。
圖1. 含方向開關(guān)復(fù)合物的細(xì)菌鞭毛馬達(dá)在逆時(shí)針和順時(shí)針旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下的冷凍電鏡電子密度和三維結(jié)構(gòu)。
激活型CheY通過FliM的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合在相鄰FliMM及FliGM結(jié)構(gòu)域外表面形成的間隙中，導(dǎo)致C ring的各結(jié)構(gòu)單元均出現(xiàn)不同程度的構(gòu)象變化，特別是FliG亞基的構(gòu)象發(fā)生了巨大變化（圖2）。CheY的結(jié)合改變了FliG亞基所有結(jié)構(gòu)域的空間位置和結(jié)構(gòu)域間的相對(duì)距離，進(jìn)而導(dǎo)致FliGCC結(jié)構(gòu)域發(fā)生了180°旋轉(zhuǎn)并向馬達(dá)中心移動(dòng)了10 ?的距離，促使與定子單元互作的FliGCC結(jié)構(gòu)域的核心螺旋結(jié)構(gòu)αtorque出現(xiàn)取向和靜電勢(shì)能分布的翻轉(zhuǎn)。C ring 的構(gòu)象變化說明定子單元須向馬達(dá)中心移動(dòng)，需要在細(xì)菌內(nèi)膜上發(fā)生重新定位，以適應(yīng)αtorque空間位置的變化。通過分析以往報(bào)道過的冷凍斷層掃描數(shù)據(jù)，結(jié)合建立含定子單元的完整鞭毛馬達(dá)結(jié)構(gòu)模型（圖3），證明了定子單元確實(shí)在細(xì)菌內(nèi)膜上發(fā)生重新定位。
圖2. 激活型CheY結(jié)合導(dǎo)致C ring發(fā)生構(gòu)象變化。
以上數(shù)據(jù)分析展示了鞭毛馬達(dá)方向轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制：在無CheY蛋白結(jié)合時(shí)，沿順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的定子單元位于C ring的FliGCC亞環(huán)的外側(cè)，驅(qū)動(dòng)鞭毛馬達(dá)沿逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)。當(dāng)CheY結(jié)合到C ring時(shí)，促進(jìn)C ring 發(fā)生構(gòu)象變化，向鞭毛馬達(dá)中心收縮并整體上移，進(jìn)而引起FliGCC結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，最終導(dǎo)致FliGCC上的αtorque發(fā)生了180°的翻轉(zhuǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定子單元從FliG外側(cè)轉(zhuǎn)到內(nèi)側(cè)，在內(nèi)膜上發(fā)生空間重定位，促使C ring以順時(shí)針方向進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，從而實(shí)現(xiàn)鞭毛馬達(dá)方向的轉(zhuǎn)換（圖3）。
圖3. 細(xì)菌鞭毛馬達(dá)方向轉(zhuǎn)換的機(jī)制模式圖。
這項(xiàng)研究工作糾正了之前所有關(guān)于C ring的組裝和結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤理解，改變了之前認(rèn)為定子是完全固定在細(xì)菌內(nèi)膜上的概念，反駁了以往所有的關(guān)于鞭毛馬達(dá)方向轉(zhuǎn)換是因?yàn)?/span>C ring的結(jié)構(gòu)外延這一假說，并向人們展示了完整鞭毛馬達(dá)三維結(jié)構(gòu)和工作機(jī)制，為設(shè)計(jì)新抗菌藥物以及新型旋轉(zhuǎn)納米機(jī)器人奠定了理論基礎(chǔ)。
朱永群教授和周艷研究員是本文的通訊作者，譚加興博士和張玲博士為本文的共同第一作者，參加研究的還有研究生周星彤和韓似玉等。浙江大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究所等單位的冷凍電鏡中心參與電鏡數(shù)據(jù)的收集工作。本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金（U23A20163和81925024）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFA0503900）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)的資助。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-024-01017-z
