氯離子是人體中最豐富的陰離子，在多個(gè)生命過程中發(fā)揮重要作用。生物體中存在多種氯離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而氯離子/氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)體ClC-3是其中的重要成員。此前的研究發(fā)現(xiàn)，生理上，ClC-3介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能被ATP增強(qiáng)，但是不受ADP或者AMP的影響，從而使得ClC-3在一定程度上發(fā)揮能量感受器的作用；病理上，已經(jīng)在多個(gè)病人上發(fā)現(xiàn)ClC-3上的點(diǎn)突變通過改變?cè)撧D(zhuǎn)運(yùn)體的功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病。然而，關(guān)于ClC-3如何受到不同腺嘌呤核苷酸的差異化調(diào)節(jié)，以及點(diǎn)突變?nèi)绾螌?dǎo)致ClC-3的功能改變的原因尚不清楚。
2024年8月6日，來自浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物物理系的楊帆團(tuán)隊(duì)與來自北京科學(xué)智能研究院、深勢科技的溫翰團(tuán)隊(duì)合作在《Nature Communications》雜志上發(fā)表了研究論文“Structural basis of adenine nucleotides regulation and neurodegenerative pathology in ClC-3 exchanger”，通過綜合使用單顆粒冷凍電鏡成像技術(shù)、單細(xì)胞膜片鉗電生理記錄和分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算模擬等多種生物物理技術(shù)，揭示了氯離子/氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)體ClC-3充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量感受器，受能量物質(zhì)-腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP）差異化調(diào)控的機(jī)制，并闡明了人類ClC-3點(diǎn)突變I607T介導(dǎo)的嚴(yán)重神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制。
研究人員首先使用冷凍電鏡技術(shù)，解析了小鼠ClC-3轉(zhuǎn)運(yùn)體處于無配體狀態(tài)的高分辨三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)運(yùn)體為同源二聚體，每個(gè)亞基具有單獨(dú)的孔隙以轉(zhuǎn)運(yùn)離子。為了進(jìn)一步明確ClC-3如何介導(dǎo)氯離子和氫離子的反向轉(zhuǎn)運(yùn)，研究人員發(fā)現(xiàn)了ClC-3的跨膜區(qū)具有分叉的氯離子和氫離子的轉(zhuǎn)運(yùn)路徑，并在該路徑上觀察到了明確的球狀電子云密度。通過結(jié)合點(diǎn)突變、膜片鉗電生理的功能實(shí)驗(yàn)和分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究人員闡明了ClC-3轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子和氫離子的機(jī)制。
接下來，研究人員使用電生理全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP）差異化調(diào)控ClC-3的電流，其中ATP和非水解ATP類似物腺苷5'-（γ-硫代）-三磷酸（ATPγS）均能激活ClC-3，而ADP和AMP卻不能。
為闡明腺嘌呤核苷酸差異化調(diào)控ClC-3的機(jī)制，研究人員解析了ClC-3分別結(jié)合ATP、ADP、AMP的高分辨三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了雖然ATP、ADP、AMP均結(jié)合至ClC-3的胞內(nèi)cystathionine-beta-synthase（CBS）結(jié)構(gòu)域，但分別誘導(dǎo)特定的構(gòu)象變化。其中，ClC-3上位于腺嘌呤核苷酸結(jié)合口袋的H89和K798殘基直接與ATP的γ磷酸相互作用，而ADP和AMP分子則遠(yuǎn)離這些氨基酸殘基，因此研究人員猜測以上殘基在腺嘌呤核苷酸差異性調(diào)控ClC-3的過程中起到關(guān)鍵作用。基于以上分析，研究人員結(jié)合電生理和基于分子動(dòng)力學(xué)模擬的路徑分析技術(shù)驗(yàn)證了以上猜想。
最后，為了揭示ClC-3人類神經(jīng)退行性疾病突變體I607T引起該轉(zhuǎn)運(yùn)體功能增強(qiáng)的機(jī)制，研究人員解析了該突變體的三維結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了I607T突變體相較于WT，兩個(gè)亞基之間發(fā)生了明顯的內(nèi)縮。為了驗(yàn)證這一結(jié)構(gòu)變化帶來的功能改變，研究人員在發(fā)生收縮的二聚體界面之處引入了點(diǎn)突變，打破兩個(gè)亞基之間的互作，最終在膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn)中，觀察到這些二聚體界面的點(diǎn)突變成功地逆轉(zhuǎn)了I607T突變體的表型，從而明確了該二聚體界面是未來精準(zhǔn)干預(yù)ClC-3點(diǎn)突變介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病的靶標(biāo)結(jié)構(gòu)域。
總之，通過綜合使用多種生物物理學(xué)技術(shù)，研究人員不僅明確了ClC-3受不同腺嘌呤核苷酸差異化調(diào)控的分子機(jī)制，并且明確指出了針對(duì)ClC-3突變介導(dǎo)神經(jīng)退行性疾病的藥物發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)區(qū)域。
浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物物理學(xué)系博士研究生萬楊卓群、郭爽爽、甄文軒和已畢業(yè)博士生徐麗臻為該工作的共同第一作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物物理學(xué)系的楊帆長聘副教授和北京科學(xué)智能研究院、深勢科技的溫翰博士為共同通訊作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院徐浩新、楊巍、張巖和郭江濤等多位老師為本研究提出了多項(xiàng)建設(shè)性建議。本研究得到了國家自然基金委和浙江省自然基金委的資助，浙江大學(xué)冷凍電鏡中心為本研究提供了支持，本研究也得到了浙江大學(xué)公共技術(shù)平臺(tái)劉雙雙等老師的大力支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-50975-w
