成熟的卵母細(xì)胞（oocyte）是哺乳動物體內(nèi)最大的細(xì)胞類型。與體細(xì)胞（somatic cell）有限的體積增長不同，卵母細(xì)胞從原始卵泡激活發(fā)育到生長完成，體積增長近500倍。但卵母細(xì)胞如何生長成為最大的細(xì)胞，還存在諸多未解之謎。卵巢中儲存的原始卵泡激活以后，卵泡中的卵母細(xì)胞要經(jīng)歷為期數(shù)周的生長期，伴隨著持續(xù)活躍的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工、核質(zhì)運輸?shù)然顒?，并在卵胞質(zhì)中積累了大量轉(zhuǎn)錄加工成熟的mRNA，為后續(xù)轉(zhuǎn)錄沉默的減數(shù)分裂、排卵和受精時期提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[1,2]。但卵母細(xì)胞如何確保這一過程中RNA的正確加工與儲存，及其對卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響還尚未清晰。
近日，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院、浙江大學(xué)紹興研究院范衡宇團(tuán)隊在Developmental Cell發(fā)表題為“RNA Surveillance by the RNA Helicase MTR4 Determines Volume of Mouse Oocytes”的研究論文，報道了RNA解旋酶MTR4參與的RNA外切體復(fù)合物（RNA exosome）作為一種RNA監(jiān)管機(jī)制，是卵母細(xì)胞生長過程中的一個關(guān)鍵檢查點，允許卵母細(xì)胞生長到巨大的體積，經(jīng)歷細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟并最終獲得發(fā)育潛能。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)了MTR4介導(dǎo)的RNA監(jiān)管機(jī)制對于維持卵母細(xì)胞正常核環(huán)境的新功能。
研究團(tuán)隊在卵母細(xì)胞中首次使用細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序的方法，定量統(tǒng)計了卵母細(xì)胞在生長過程中整體mRNA水平及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)這兩種亞細(xì)胞組分中mRNA分布比例的變化，并鑒定出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄物的不同剪接加工特征，提出RNA監(jiān)管機(jī)制可能在其中發(fā)揮重要功能。通過對RNA外切體復(fù)合物的前期調(diào)研，該研究采用在卵母細(xì)胞中條件性敲除Mtr4這一基因來實現(xiàn)對卵母細(xì)胞中RNA監(jiān)管機(jī)制的破壞?；诨蚯贸蟮谋硇头治龊突匮a(bǔ)實驗證實了MTR4缺失會給小鼠卵母細(xì)胞造成無法逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重的成熟障礙，包括卵母細(xì)胞體積明顯減小，無法完成卵子成熟所必須的核構(gòu)象轉(zhuǎn)變、基因組轉(zhuǎn)錄沉默和減數(shù)分裂恢復(fù)。
圖1: Mtr4條件性敲除小鼠卵母細(xì)胞的表型。
A: RNA 外切體降解途徑的不同復(fù)合物中主要成分的示意圖。B: 從Mtr4fl/fl和Mtr4fl/fl;Zp3-Cre小鼠卵巢中收集的卵母細(xì)胞的代表性圖像。C:卵母細(xì)胞直徑統(tǒng)計。
通過熒光原位雜交實驗和核質(zhì)分離測序等實驗，該研究證明了MTR4缺失后RNA監(jiān)管機(jī)制失效，導(dǎo)致大量未成熟RNA滯留在細(xì)胞核中，與此同時細(xì)胞質(zhì)中的成熟mRNA儲量也大幅下降。生信分析表明，MTR4缺失后核中滯留的轉(zhuǎn)錄本多為加工不完全的廢物RNA，部分內(nèi)含子異常保留的轉(zhuǎn)錄本甚至被進(jìn)一步運輸?shù)桨|(zhì)中。通過在 Mtr4 敲除的卵母細(xì)胞中顯微注射回補(bǔ)MTR4，檢測到異常累積的轉(zhuǎn)錄本含量明顯減少，證實了MTR4介導(dǎo)的RNA 監(jiān)管機(jī)制在監(jiān)管RNA質(zhì)量和維持RNA正常的核質(zhì)分布比例中發(fā)揮直接作用。
圖2: MTR4 缺失導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)mRNA的累積和細(xì)胞質(zhì)mRNA減少。
A: 卵母細(xì)胞的核質(zhì)分離測序的收樣時間點及所使用測序方法的示意圖。B: Poly(A) RNA-seq中Mtr4fl/fl和Mtr4-null卵母細(xì)胞的細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)的相對 mRNA 拷貝數(shù)及對應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的比值。C-D: 核質(zhì)分離Poly(A) RNA-seq中的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的散點圖。E-F: FISH檢測poly(A) RNA信號。
Mtr4 敲除小鼠卵母細(xì)胞RNA 監(jiān)管機(jī)制失效后，卵母細(xì)胞發(fā)育過程中核構(gòu)象由NSN向SN轉(zhuǎn)變失敗。通過進(jìn)一步的表型鑒定及染色質(zhì)開放性分析（ATAC-seq），發(fā)現(xiàn)核中異常累積的RNA造成了染色質(zhì)開放程度增加，染色質(zhì)無法正常凝集并轉(zhuǎn)錄沉默；CUT&Tag測序分析也揭示了與轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的組蛋白修飾H3K4me3在染色質(zhì)上分布異常。除影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)外，核中異常累積的RNA還造成了細(xì)胞核區(qū)室化結(jié)構(gòu)的異常，包括核斑點和核仁無法正常組裝。以上實驗結(jié)果揭示了MTR4 介導(dǎo)的RNA 監(jiān)管機(jī)制在維持卵母細(xì)胞健康的核環(huán)境及促進(jìn)細(xì)胞核成熟方面的重要功能，也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RNA穩(wěn)態(tài)負(fù)反饋調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象、組蛋白修飾建立和核內(nèi)區(qū)室化結(jié)構(gòu)的形成。
圖3: RNA監(jiān)管機(jī)制失效后卵母細(xì)胞的細(xì)胞核環(huán)境紊亂。
A: MTR4缺失后卵母細(xì)胞核構(gòu)象由NSN向SN轉(zhuǎn)變失敗。B: MTR4缺失后卵母細(xì)胞無法轉(zhuǎn)錄沉默。C: MTR4缺失后PABPN1介導(dǎo)的NPAD結(jié)構(gòu)和nuclear speckles無法正常形成。
此外，該研究還提出RNA 監(jiān)管機(jī)制通過以下兩個方面影響卵母細(xì)胞的生長和胞質(zhì)成熟。（1）維持健康的核環(huán)境，保證了卵母細(xì)胞生長過程中的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工活動，在胞質(zhì)中累積足量的正常轉(zhuǎn)錄本。（2）保證了核仁正常的組裝與功能，為細(xì)胞質(zhì)的蛋白翻譯提供核糖體機(jī)器。綜上，MTR4介導(dǎo)的RNA監(jiān)管機(jī)制確保了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中豐富的mRNA積累和有序儲存，對于決定卵母細(xì)胞的體積和發(fā)育潛能具有重要生理意義。
圖4: RNA監(jiān)管機(jī)制確保小鼠卵母細(xì)胞生長成熟的模式圖
該課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，Poly(A)結(jié)合蛋白PABPN1具有對新生RNA進(jìn)行剪切、加尾、保護(hù)和儲存的重要功能[3]。PABPN1通過介導(dǎo)液-液相分離形成細(xì)胞核內(nèi)的特定功能區(qū)域nuclear poly(A) domain (NPAD)，調(diào)控卵子發(fā)生過程中mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工。MTR4和PABPN1同屬于RNA外切體復(fù)合物，兩者的敲除小鼠卵母細(xì)胞在分子水平上均存在RNA加工異常、不能有效建立起母源mRNA儲備等問題，并具有卵母細(xì)胞體積減小、發(fā)育成熟障礙等相似的表型。這一系列研究揭示了卵母細(xì)胞生長過程中的mRNA轉(zhuǎn)錄后加工調(diào)控和監(jiān)管對于建立卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的重要作用，為解析卵母細(xì)胞如何生長成為體內(nèi)最大的細(xì)胞提供了新的理論。
浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院范衡宇教授團(tuán)隊的博士生吳韻雯（已畢業(yè)）為本文第一作者。本研究受國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學(xué)基金、國家萬人計劃、浙江省自然科學(xué)基金項目和浙江省重點研發(fā)計劃等項目資助。中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越中心程紅教授課題組也對本研究提供了大力支持。
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https://www.cell.com/developmental-cell/abstract/S1534-5807(24)00537-9
